案例 1：

2018 高級(jí)別漿液性卵巢癌（high-grade serous ovarian carcinoma）是致死率高的婦科惡性腫瘤。目前對(duì)漿液性卵巢癌的治療方案創(chuàng)新極其受限，主要原因之一就是缺乏一個(gè)穩(wěn)定的腫瘤分子分型體系。2020 年 2 月 10 日，牛津大學(xué) Weatherall 分子醫(yī)學(xué)研究所 Ahmed A. Ahmed 實(shí)驗(yàn)室和曼徹斯特大學(xué) Christopher Yau 研究組在 Cancer Cell（IF=26.6）雜志發(fā)表相關(guān)研究論文 ^[1]。這項(xiàng)研究通過(guò)深度單細(xì)胞 RNA 測(cè)序技術(shù) Smart-Seq2 刻畫(huà)了人輸卵管上皮組織，共測(cè)序了約 6000 個(gè)主要來(lái)自非卵巢癌病人的正常輸卵管上皮細(xì)胞（非癌細(xì)胞），發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了輸卵管上皮內(nèi)的 6 種新細(xì)胞亞型，包括 4 種分泌細(xì)胞亞型，1 種分泌 - 纖毛中間態(tài)細(xì)胞亞型以及 1 種特殊的組織原位 T 細(xì)胞。非癌癥病人和癌癥病人的輸卵管上皮細(xì)胞都有 Cellcycle, EMT, Differentiated 和 KRT17 cluster 四個(gè)亞群的細(xì)胞。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn) TCGA 和 AOCS 數(shù)據(jù)庫(kù)很大比例的樣本都可以通過(guò) 52 個(gè) marker 基因（7 differentiated markers, 10 KRT17 cluster markers, 12 EMT markers, 15 cell-cycle markers, 和 8 ciliated markers）形成的 panel 進(jìn)行主要分群。研究者們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)“分解”分析（deconvolution）中的 EMT（epithelial-mesenchymal transition，上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化）細(xì)胞狀態(tài)的比例和病人預(yù)后顯著負(fù)相關(guān)，12 個(gè) EMT marker 顯示表達(dá)比例越高的病人其生存期越低，且這一相關(guān)性在九個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)庫(kù)中都可被重復(fù)出來(lái)。為了進(jìn)一步證明 EMT 及其他四種細(xì)胞狀態(tài)的信號(hào)可來(lái)自于癌細(xì)胞，研究者們利用激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM）獲取了純度更高的腫瘤樣本，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì) LCM 樣本數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)了在 TCGA 等公共數(shù)據(jù)庫(kù)里的發(fā)現(xiàn)，并通過(guò)免疫熒光染色在組織切片和卵巢癌細(xì)胞系 KURAMOCHI 中進(jìn)行了驗(yàn)證。總之，這項(xiàng)研究利用單細(xì)胞測(cè)序定義了一個(gè)腫瘤分子分型體系，對(duì)卵巢癌的預(yù)后分析帶來(lái)重要影響。

案例 2：

CD73 是一個(gè)抗腫瘤的熱門(mén)靶點(diǎn)。免疫檢查點(diǎn)療法（ICT)，例如抗 CTLA- 4 和抗 PD-1/PD-L1 已經(jīng)極大地變革了人們對(duì)多種腫瘤的治療方式。但是臨床上只對(duì)部分特定腫瘤類型的患者提供持久的抗腫瘤反應(yīng)。腫瘤特異性免疫檢查點(diǎn)靶向的機(jī)制基礎(chǔ)尚不清楚。為了深入了解腫瘤特異性免疫調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，來(lái)自美國(guó)德克薩斯大學(xué) MD 安德森癌癥中心 Padmanee Sharma 研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)分析多種病人來(lái)源的 5 種不同類型腫瘤中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞分型，發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤中特異性存在 CD73(hi) 的巨噬細(xì)胞。研究團(tuán)隊(duì)對(duì)四個(gè) GBM 腫瘤進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 ^[3]，細(xì)胞分成了 17 個(gè)亞群，包含了 4 個(gè) CD3+ T 細(xì)胞和 10 個(gè) CD3?CD68+ 髓系細(xì)胞。在 10 個(gè) CD3?CD68+ 髓系細(xì)胞中，其中有 4 個(gè)是 CD73(hi)。ScRNA-seq 顯示 CD73(hi) 髓樣細(xì)胞富含免疫抑制基因，并且具有與常駐小膠質(zhì)細(xì)胞特征不同的特征。將 CD73 巨噬細(xì)胞的基因與癌癥基因組圖譜（TCGA) 中的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本進(jìn)行比較，結(jié)果表明 CD73 高表達(dá)的巨噬細(xì)胞的基因特征與存活率下降相關(guān)。研究人員分析了 5 名接受過(guò) PD- 1 抑制劑 Keytruda 治療和 7 名未接受過(guò) PD- 1 抑制劑治療的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，均發(fā)現(xiàn)了表達(dá) CD73 的巨噬細(xì)胞簇，說(shuō)明抗 PD- 1 治療沒(méi)有使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的微環(huán)境發(fā)生明顯改變。

▲圖 CD73(hi) 巨噬細(xì)胞特異性存在于 GBM 中 ^[2]

為驗(yàn)證 CD73 是否可以在 GBM 治療中作為一種聯(lián)合治療的靶點(diǎn)。研究人員在 WT 和 CD73-/- 小鼠中構(gòu)建 GL261 GBM 腫瘤模型，CD73 的缺失可以通過(guò)調(diào)控腫瘤內(nèi)髓系細(xì)胞的亞群改變而提高小鼠生存。同時(shí)，CD73 的缺失可以提高 GBM 小鼠模型對(duì)抗 PD- 1 和抗 CTLA- 4 聯(lián)合治療的響應(yīng)，提高了 iNOS+ 免疫刺激巨噬細(xì)胞和顆粒酶素 B + CD8 T 細(xì)胞在瘤內(nèi)比例。腫瘤微環(huán)境中存在多種免疫檢查點(diǎn)，本研究通過(guò)對(duì)多種不同類型腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)免疫細(xì)胞分析，發(fā)現(xiàn)不同免疫檢查點(diǎn)的存在是有腫瘤類型特異性的，其中 CD73hi 髓系細(xì)胞亞群，特異性出現(xiàn)在 GBM 中，靶向 CD73 分子可提高機(jī)體對(duì)免疫檢查點(diǎn)療法的響應(yīng)和療效。

▲圖 在 GBM 小鼠模型中，CD73 的缺失增強(qiáng)了 ICT 的療效 ^[2]

引用文獻(xiàn)：

[1]. Hu Z, Artibani M, Alsaadi A, et al. The Repertoire of Serous Ovarian Cancer Non-genetic Heterogeneity Revealed by Single-Cell Sequencing of Normal Fallopian Tube Epithelial Cells[J]. Cancer Cell, 2020, 37(2):226-242.

[2]. Goswami S, Walle T, Cornish A E, et al. Immune profiling of human tumors identifies CD73 as a combinatorial target in glioblastoma[J]. Nature Medicine, 2020, 26(1):1-8.

案例 1：抗體藥 PD1/PDL1

腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes, TIL）：浸潤(rùn)在腫瘤內(nèi)的淋巴細(xì)胞，以 T 細(xì)胞為主，也含有其他免疫細(xì)胞。由于里邊含有能夠識(shí)別殺傷腫瘤的 T 細(xì)胞（腫瘤反應(yīng)性 T 細(xì)胞，tumor reactive T cells）而備受關(guān)注。阻斷 T 細(xì)胞抑制性檢查點(diǎn)受體的免疫療法已經(jīng)改變了癌癥患者的臨床護(hù)理。然而 T 細(xì)胞對(duì)檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)是否依賴于預(yù)先存在的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的再激活或新 T 細(xì)胞的募集尚不清楚。2019 年一項(xiàng)發(fā)表于 Nature Medicine 上的研究從 11 位診斷為基底細(xì)胞癌患者接受 PD- 1 抑制劑治療前后的組織標(biāo)本中獲取 T 細(xì)胞進(jìn)行 RNA 單細(xì)胞測(cè)序和 TCR 測(cè)序，以研究 PD- 1 抑制劑是否通過(guò)腫瘤浸潤(rùn) T 細(xì)胞的“再激活”或是通過(guò)招募新的 T 細(xì)胞到達(dá)腫瘤區(qū)域發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng) ^[3]。

▲圖 11 例患者治療前后所有腫瘤細(xì)胞聚類 ^[3]

本研究的重點(diǎn)是免疫細(xì)胞，尤其是浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞，以及治療前后的變化，以了解克隆性 T 細(xì)胞對(duì) PD- 1 抗體治療的反應(yīng)。因此研究人員把所有的 33106 個(gè)腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞做了個(gè)更細(xì)致的分類，包括表達(dá) CD4 的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Treg）細(xì)胞，濾泡輔助性 T（TFH）細(xì)胞，T 輔助細(xì)胞 17（TH17）細(xì)胞；以及表達(dá) CD8 的幼稚細(xì)胞，記憶 T 細(xì)胞，效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞，活化 T 細(xì)胞，慢性活化 / 耗竭 T 細(xì)胞，中度耗竭 / 活化細(xì)胞。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在 PD- 1 抗體治療之后，濾泡輔助性 T 細(xì)胞，以及活化，耗竭和耗竭 / 活化的 CD8 陽(yáng)性 T 細(xì)胞的頻率增加，并且耗竭 T 細(xì)胞的克隆水平明顯更高。更為讓研究人員感到意外的是，對(duì)于同一個(gè)患者而言，治療后記憶 T 細(xì)胞和效應(yīng) T 細(xì)胞頻繁轉(zhuǎn)換為活化狀態(tài)，但是治療前的耗竭 T 細(xì)胞卻沒(méi)有變成治療后的非耗竭表型。這表明，即使在 PD- 1 抗體治療后，已經(jīng)耗竭的腫瘤浸潤(rùn) T 細(xì)胞也很難再變成活化狀態(tài)。此外，研究人員還觀察到一個(gè)有趣的現(xiàn)象，PD- 1 抗體治療后才出現(xiàn)的耗竭性 T 細(xì)胞表現(xiàn)出了新的 TCR 特異性。為了分析外周血中是否存在新發(fā)現(xiàn)的腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞，研究人員給患者的血液樣品做了 TCR 測(cè)序，發(fā)現(xiàn) 35.5% 新腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞可以在 PD- 1 抗體治療后的外周血中找到，而在治療前的外周血中只能找到 11.8% 的新腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞，不過(guò)治療前的腫瘤里面卻沒(méi)有新腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞。總的來(lái)說(shuō)，與“冷”腫瘤相比，“熱”腫瘤之所以響應(yīng) PD- 1 抗體的治療，可能是由于“熱”腫瘤自身的特性，讓它能夠不斷吸引新 T 細(xì)胞進(jìn)入，而不是重新激活已有的腫瘤浸潤(rùn)性 T 細(xì)胞。這項(xiàng)研究讓我們對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的作用機(jī)制有了新的認(rèn)知，這對(duì)臨床治療和療效的檢測(cè)都有一定的價(jià)值和意義。

案例 2：細(xì)胞治療

目前，以 CD19 為靶點(diǎn)的 CAR- T 細(xì)胞治療已被證明對(duì)復(fù)發(fā)性、難治性 B 細(xì)胞惡性腫瘤如 B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）、急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）和慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）有顯著的治療作用 ^[4]。雖然抗 CD19 CAR- T 細(xì)胞治療的早期結(jié)果令人欣喜，但是只有不到一半的患者出現(xiàn)了長(zhǎng)期的緩解，這意味著大多數(shù)患者在接受治療后要么沒(méi)有反應(yīng)要么出現(xiàn)了復(fù)發(fā)。CAR- T 細(xì)胞治療在不同患者中出現(xiàn)的這些差異的原因到底是什么？2020 年 10 月 5 日在線發(fā)表在《Nature Medicine》雜志上的文章探討了這一問(wèn)題。對(duì) 24 例大 B 細(xì)胞淋巴瘤（LBCL) 患者輸注自體 CAR- T 細(xì)胞后，研究人員對(duì) 137,326 個(gè)殘留的細(xì)胞進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組 scRNA-seq^[5]。

▲圖 工作流程圖 ^[5]

比較全部恢復(fù)（CR) 患者和疾病進(jìn)行 / 部分恢復(fù)（PR/PD) 患者輸注產(chǎn)物的細(xì)胞類型和功能狀態(tài)，研究人員發(fā)現(xiàn) PR/PD 患者的輸注產(chǎn)物中衰竭的 CD8 和 CD4 T 細(xì)胞顯著富集，而 CR 患者的輸注產(chǎn)物中記憶 CD8 T 細(xì)胞顯著富集。CR 患者和 PR/PD 患者 CD8 T 細(xì)胞的差異表達(dá)基因（DEG）鑒定出 4 類細(xì)胞群，這些差異表達(dá)基因大多與 CD8 T 細(xì)胞的激活和衰竭有關(guān)，雖然每個(gè)細(xì)胞群都包含來(lái)自所有患者的細(xì)胞，但是來(lái)自 CR 患者的細(xì)胞的相對(duì)比例在各個(gè)細(xì)胞群之間存在顯著差異。CD4 T 細(xì)胞的 DEG 分析和聚類也表現(xiàn)出類似結(jié)果，不同的是增殖相關(guān)基因和周期細(xì)胞在 CR 患者的高頻細(xì)胞聚類中表達(dá)較高。由此強(qiáng)調(diào)了與臨床療效相關(guān)的 CAR- T 細(xì)胞輸注產(chǎn)物細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄特征。研究表明輸注的 CAR T 細(xì)胞產(chǎn)物的細(xì)胞和分子多樣性是導(dǎo)致經(jīng)抗 CD19-CAR- T 細(xì)胞治療的 LBCL 患者療效和毒性差異的主要因素，與輸注產(chǎn)物相關(guān)的可量化表型可通過(guò)在其產(chǎn)生過(guò)程中富集所需的、或消除不期望的細(xì)胞群體或功能狀態(tài)而發(fā)揮作用。對(duì)離散細(xì)胞群導(dǎo)致反應(yīng)不良或高毒性的機(jī)制的了解，可能有助于發(fā)現(xiàn)治療干預(yù)的途徑，從而提高療效，降低 CAR- T 細(xì)胞輸注后的毒性。

引用文獻(xiàn)

[3]. Li X, Wang M, Xiang R. Clonal replacement of novel T cells: a new phenomenon in the tumor microenvironment following PD-1 blockade[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2019, 4:43.

[4] Neelapu Sattva S, Locke Frederick L, Bartlett Nancy L, et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma[J]. New England Journal of Medicine, 2017, 377:2531-2544.

[5] Deng Qing, Han Guangchun, Puebla-Osorio Nahum, et al. Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas[J]. Nature Medicine, 2020, 26:1878-1887.

案例 1：病毒疫苗

謝曉亮教授團(tuán)隊(duì)利用高通量單細(xì)胞 RNA 和 VDJ 測(cè)序平臺(tái)，從 60 位康復(fù)期病人身上篩選出 8558 種病毒蛋白結(jié)合抗體序列，成功找出 14 株高活性的中和抗體。其中編號(hào)為 BD-368- 2 的抗體表現(xiàn)突出，在假病毒實(shí)驗(yàn)中的半抑制濃度（IC50）達(dá)到 1.2 ng/mL（8pM）；在軍事醫(yī)學(xué)研究院 P3 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的真病毒實(shí)驗(yàn)中，IC50 達(dá)到 15 ng/mL（100pM）。中和抗體體內(nèi)抗病毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，利用 hACE2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型，感染 SARS-Cov- 2 后給予 BD-368- 2 的治療使病毒載量下降～2400 倍。而注射 BD-368- 2 后可完全抑制小鼠的病毒感染，達(dá)到預(yù)防效果。研究團(tuán)隊(duì)還利用冷凍電鏡得到新冠病毒 Spike 三聚體與中和抗體的高分辨率 3.8?三維結(jié)構(gòu)密度圖。數(shù)據(jù)顯示，抗原上的中和抗體表位與 ACE2 的結(jié)合位點(diǎn)重合，從而揭示出中和作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。此外，研究人員還證明了可以根據(jù) CDR3H 結(jié)構(gòu)的相似性來(lái)選擇 SARS-CoV- 2 中和抗體 ^[7]。

案例 2：病毒疫苗

范德比爾特大學(xué)的研究組在 Cell 雜志上發(fā)表文章 ^[8]，提出了一種名為 LIBRA-seq 的新的測(cè)序技術(shù)。作者構(gòu)建了一個(gè)特殊的抗原庫(kù)，將抗原連接上 DNA 條碼和用于流式細(xì)胞術(shù)分選的熒光標(biāo)簽。接下來(lái)，將這個(gè)庫(kù)與富含 B 細(xì)胞的樣本共孵育。將連有熒光標(biāo)簽的抗原和與之結(jié)合的 B 細(xì)胞共同分選出來(lái)，并進(jìn)行測(cè)序，從而得到 BCR- 抗原序列圖譜。利用 LIBRA-seq，研究人員繪制了來(lái)自兩名 HIV 感染者的數(shù)千個(gè) B 細(xì)胞的抗原特異性圖譜，許多 HIV 和流感特異性抗體的預(yù)測(cè)特異性得到證實(shí)。這項(xiàng)技術(shù)可以有效地繪制 BCR 序列及其對(duì)應(yīng)的特異性抗原圖譜，在抗體研發(fā)和疫苗制備領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

案例 3：個(gè)性化腫瘤疫苗

NeoVax 是一種新抗原（Neoantigen）腫瘤疫苗，主要以新抗原為靶點(diǎn)。新抗原通常是腫瘤細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，隨機(jī)突變產(chǎn)生的新的蛋白質(zhì)或多肽，一般特異性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中但不存在與正常組織細(xì)胞中。因此，新抗原也成為了腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)。早在 2017 年，美國(guó) Dana Farber 癌癥研究所應(yīng)用 NeoVax 治療惡性黑色素瘤患者，并取得的良好療效。6 名高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者在術(shù)后 18 周開(kāi)始接受 NeoVax 疫苗治療。在接種后的 2 年多時(shí)間內(nèi)，4 名患者未發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)；另外 2 名惡性黑色素瘤伴肺轉(zhuǎn)移的患者，在接種疫苗后復(fù)發(fā)，隨即開(kāi)始接受 PD-1 單抗藥物的治療，也獲得完全緩解并處于無(wú)疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài) ^[9]。為了進(jìn)一步探究 NeoVax 腫瘤疫苗的遠(yuǎn)期臨床療效及其機(jī)制，研究人員對(duì)上述 6 名患者及新入組的 2 名患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪。在術(shù)后 4 年多（55 個(gè)月）的中位數(shù)隨訪中，8 名患者全部存活，其中 3 名患者仍未出現(xiàn)復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)的 5 名患者中，2 名 IV 期患者接受 pembrolizumab（PD- 1 單抗）治療后完全緩解（2017 年已報(bào)道），1 名患者接受了手術(shù)切除且仍未發(fā)現(xiàn)疾病證據(jù)（NED），2 名患者發(fā)展為不可切除的轉(zhuǎn)移性疾病。

對(duì)于如此令人興奮的長(zhǎng)期臨床療效，研究人員期望揭示患者體內(nèi)的變化和機(jī)制。研究人員首先試圖確定 NeoVax 疫苗誘導(dǎo)的特異性 T、細(xì)胞在外周血中的功能狀態(tài)是如何演變的。他們對(duì)新抗原特異性 T 細(xì)胞，尤其是 CD4+ T 細(xì)胞的特征進(jìn)行了跟蹤和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NeoVax 疫苗誘導(dǎo)的新抗原特異性 CD4+ T 細(xì)胞表現(xiàn)出記憶性和細(xì)胞毒性特征。進(jìn)一步分析了這些患者的 T 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些患者體內(nèi)不僅產(chǎn)生了靶向的目標(biāo)新抗原的特異性 T 細(xì)胞，而且還擴(kuò)展到識(shí)別其他與黑色素瘤相關(guān)的新抗原，起到了更強(qiáng)更持久的抗腫瘤效果 ^[10]。

引用文獻(xiàn)：

[7]. Yunlong Cao, Bin Su, Xianghua Guo, et al. Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients’B Cells[J]. Cell, 2020, 182(1):73-84.

[8]. Setliff I, Shiakolas A R, Pilewski K A, et al. High-Throughput Mapping of B Cell Receptor Sequences to Antigen Specificity[J]. Cell, 2019, 179(7):1636-1646.

[9]. Ott PA, Hu Z, Keskin DB, et al. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma[J]. Nature, 2017, 547(7662):217-221.

[10]. Zhuting Hu, Donna E Leet, Rosa L Alles?e, et al. Personal neoantigen vaccines induce persistent memory T cell responses and epitope spreading in patients with melanoma[J]. Nature Medicine, 2021, 27(3):515-525.